一文帶你看遍當(dāng)今的基因治療

基因治療方案和藥物在全球范圍內(nèi)接連獲批，2017年美國接連批準(zhǔn)了三項基因治療的上市，兩個基因治療方案和一個直接給藥型的基因治療藥物。國內(nèi)也不遑多讓，12月8日至12月29日，已有多達(dá)5家企業(yè)的申報獲得受理，另有一些公司也在積極布局CAR-T免疫療法，有望在2018年申報臨床。

基因治療重返中心舞臺，小編帶你迅速瀏覽當(dāng)下全球的基因治療現(xiàn)狀。

世界上第一個獲得授權(quán)的基因轉(zhuǎn)移研究誕生在1989年的NIH（National Insititutes of Health, 國立衛(wèi)生研究院）。在這項標(biāo)志性的研究中，腫瘤浸潤的淋巴細(xì)胞被收集起來，用逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行遺傳標(biāo)記用于檢查這些細(xì)胞的“腫瘤歸巢”能力。這一研究為證明“遺傳改變的人類細(xì)胞回輸入病人體內(nèi)后并不對人體造成傷害“提供了第一個直接證據(jù)。截止到2012年6月，全球已有31個國家共1843例臨床試驗已獲授權(quán)、啟動或已完結(jié)。回顧過往，2007年僅有28個國家的1309例臨床試驗，而2004年僅有24個國家的918例臨床試驗。有意思的是，盡管試驗的總數(shù)量在逐步增長，但這期間的增長率卻在輕微放緩。另外一個值得注意的差別在于進(jìn)入臨床試驗晚期的試驗比例，絕大多數(shù)的臨床試驗仍然停留在臨床I期和臨床I/II期。

這些絕大多數(shù)的早期臨床試驗為基因治療提供了無價的概念驗證，確認(rèn)了對目標(biāo)細(xì)胞定向改變能夠成功的引起細(xì)胞表型的變化。然而在大多數(shù)的臨床功能試驗中，基因改造細(xì)胞的數(shù)量還不足以達(dá)到治療的效果。盡管治療效果欠佳的報告數(shù)量有所增加但基因治療領(lǐng)域仍在繼續(xù)發(fā)展。其中最值得注意的是幾種疾病，如原發(fā)性免疫缺陷、萊伯先天性黑蒙癥、血友病B、X連鎖的腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良（X-ALD）的治療。X-ALD是一種致命的脫髓鞘中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，一部電影《洛倫佐的油》使得這一疾病為人所知。這是慢病素載體被成功應(yīng)用于治療人類的基因缺陷病的首次報道，也是嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療史上的巨大成功。

也有首次使用免疫治療方法成功的臨床試驗報道，雖然接受治療的患者人群在2012年還很少。這些試驗中，患者接受了工程改造后能夠識別腫瘤的T淋巴細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞的這一功能是γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體編碼的直接針對腫瘤相關(guān)抗原的T細(xì)胞受體所賦予的?？傮w而言，臨床反應(yīng)變化多端，但重要的是，一小部分患者在接受治療后得到了緩和。嵌合抗原受體（CARs）在2012年時，作為基于自身靶向腫瘤相關(guān)細(xì)胞表面抗原的自體細(xì)胞療法進(jìn)已進(jìn)入臨床。費城阿拉伯森癌癥研究中心的研究人員描述了18例患有慢性淋巴細(xì)胞白血病的病人中3例在接受自體淋巴細(xì)胞治療后獲得的良好早期結(jié)果。

表1. 已獲批的基因治療藥物

自2012年開始，全球新增基因治療臨床試驗754例。其中最引人注目的領(lǐng)域當(dāng)屬利用CAR-T細(xì)胞靶向腫瘤相關(guān)細(xì)胞表面抗原的腫瘤的免疫治療。這一方案已受到廣泛關(guān)注，在許多其他腫瘤治療方案已經(jīng)失敗的情況下它能夠匯聚細(xì)胞毒T細(xì)胞的殺傷潛力和持久性與單克隆抗體的特異性以殺傷腫瘤。從2011年新英格蘭醫(yī)藥雜志報道了一例病人接受轉(zhuǎn)導(dǎo)了能夠表達(dá)B細(xì)胞特異性抗原CD19的自體T細(xì)胞輸注后達(dá)到完全緩解后，已有數(shù)百名患者在多次試驗中接受了CAR-T 19 這一激動人心的治療方式，在患有白血病或淋巴瘤尤其是急性淋巴白血病的患者中達(dá)到了前所未有的緩解率。這一療法走向臨床成為“免疫療法”，被科學(xué)雜志評為2013年的突破性進(jìn)展。值得注意的是，到2017年5月，Emily Whitehead 作為首個在費城兒童醫(yī)院接受CAR-T細(xì)胞治療的兒科患者已經(jīng)5年沒有復(fù)發(fā)，并且首個CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品-Kymriah也在2017年被FDA批準(zhǔn)上市。靶向?qū)嶓w瘤如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是目前治療中的一大挑戰(zhàn)，相關(guān)報道正日益增加。

Cellectis正致力用TALEN技術(shù)編輯健康人來源的T細(xì)胞嵌合抗原受體（CAR），以利用健康人的血液獲得“現(xiàn)成”的免疫療法產(chǎn)品。這一通用CAR-T的臨床試驗于2017年2月獲得FDA的批準(zhǔn)，但由于出現(xiàn)受試者死亡案例，于2017年9月被FDA叫停?；颊叩乃酪蛑赶蛄酥委煱悬cCD123的選擇，而并不在于對“通用型”CAR的免疫反應(yīng)，因兩名患者均未報道有GvHD移植物抗宿主反應(yīng)。目前這款通用型CAR-T的研發(fā)仍然處于不確定狀態(tài)，但利用健康人血開發(fā)“通用”的腫瘤免疫療法對于免疫力低下而無法在自身血液中獲得足夠的T淋巴細(xì)胞的腫瘤患者而言仍是一個重要的發(fā)展方向。

  如今，美國已將CAR-T療法納入醫(yī)保，F(xiàn)DA也批準(zhǔn)了全球首款CAR-T療法Kymriah的第二個適應(yīng)癥——復(fù)發(fā)或難治性大B細(xì)胞淋巴瘤。好消息仍在不斷傳來，cell雜志報道了一款SUPRA CAR-T。SUPRA CAR-T將T細(xì)胞從系統(tǒng)的靶點感知部分（the target-sensing portion of the system，SUPRA CAR-T系統(tǒng)中用于識別癌細(xì)胞上靶點的抗體部分）分離了出來，使系統(tǒng)擁有了切換靶點的能力。這一款通用型CAR-T是一種分離的、通用、可編程式(split,universal, and programmable，SUPRA)CAR 系統(tǒng)，用于T細(xì)胞治療。能夠很好地調(diào)控T細(xì)胞激活程度以消除毒性;能夠感知多種抗原并做出響應(yīng)以對抗癌癥復(fù)發(fā);還誘導(dǎo)控制細(xì)胞類型特異性的信號。這一系統(tǒng)的出現(xiàn)有望提供更安全、更有效的癌癥治療。

Cell（DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.03.038）

Emily Whitehead 2013-2016 

自上次報道以來，單基因遺傳病在治療方面有了極大的穩(wěn)步進(jìn)展。截止2017年11月，11.1%的臨床試驗集中在單基因遺傳病領(lǐng)域，而其在2012、2007和2004的歷史數(shù)據(jù)分別為全部試驗的8.7%、8.3%和9.8%。

在囊性纖維化的治療中，非病毒的基因治療能夠改善肺功能的概念已經(jīng)一個隨機(jī)的、雙盲、安慰劑對照的臨床IIB期試驗驗證。這一試驗中，78例患者接受了陽離子脂質(zhì)體包裹的編碼CFTR cDNA的質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)。盡管收效甚微并且僅在個別受試者身上起效，但這一試驗證明了其安全性并為未來試驗的改進(jìn)如增加劑量和頻次打下了基礎(chǔ)。

針對免疫缺陷的臨床試驗仍在繼續(xù)顯示其顯著的臨床效果，超過150例合并缺陷患者接受了γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒和最近基于慢病毒的基因轉(zhuǎn)移治療。在腺苷脫氨酶缺乏癥（ADA-SCID）的治療方面，超過40例患者接受了治療，疾病的存活率超過70%。值得注意的是，Struimviv（葛蘭素史克公司），基于里程碑式的米蘭試驗已于2016年獲得了歐洲市場授權(quán)局（EMA）的市場批準(zhǔn)，代表了第一個靶向干細(xì)胞的的基因治療體外方案在歐洲獲批。盡管經(jīng)過長期的追蹤在ADA-SCID的治療中并沒有觀察到與載體的基因毒性相關(guān)的不良事件，但使用慢病毒進(jìn)行治療的臨床試驗逐漸增多。使用慢病毒對原發(fā)性免疫缺陷如X連鎖重癥免疫缺陷（X1-SCID）和Wiskott-Aldrich的治療也有報道，并顯示出相對于γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體更好的安全性。

慢病毒載體在靶向造血干細(xì)胞治療遺傳性神經(jīng)疾病ALD和異染性白質(zhì)營養(yǎng)不良中的應(yīng)用也取得了可喜的成果，并且類似的方法也被用于血紅蛋白病的治療，包括鐮狀細(xì)胞病患者的早期報道。在藍(lán)鳥生物贊助的一項試驗中，治療后15個月，鐮狀球蛋白β抗體的水平約為β球蛋白的一半，疾病表征也得到了糾正。β地中海貧血的基因治療，尤其是那些還殘存β球蛋白表達(dá)的病人的治療報道也令人充滿希望，全球范圍內(nèi)目前已經(jīng)開展了六項臨床試驗。2018年4月19日新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志發(fā)表了哈佛醫(yī)學(xué)院Leboulch等研究組用BB305載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的自體CD34 +細(xì)胞的基因治療減少或消除了對22名患有嚴(yán)重β地中海貧血的患者長期紅細(xì)胞輸血的需要，而沒有與藥物產(chǎn)品相關(guān)的嚴(yán)重不良事件。這一里程碑式的試驗成功新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志的給予了高度贊賞，出版了專門的點評文章。目前世界上關(guān)于地中海貧血的基因治療還有兩項臨床試驗正在進(jìn)行中。由Meorial Solan Kattering醫(yī)院主導(dǎo)的臨床試驗使用了相對溫和的清髓預(yù)處理方法，也獲得了與哈佛醫(yī)學(xué)院相似的滿意結(jié)果，而國內(nèi)的地中海貧血基因治療試驗正在廣州南方醫(yī)院進(jìn)行。

基于腺相關(guān)病毒（AAV）載體的治療也在臨床相顯現(xiàn)了令人印象深刻的結(jié)果，這反映在一些專門的基因治療期刊中關(guān)于這一載體系統(tǒng)的特征性討論中。在這些試驗中值得關(guān)注的包括α-1抗胰蛋白酶缺乏癥、血友病A和B以及眼科疾病的基因治療。用于治療脂蛋白脂酶缺乏癥的AAV載體在2012年獲得EMA批準(zhǔn)后已被uniQure公司市場化為Glybera。而美國第一個基于AAV的基因治療產(chǎn)品voretigene neparvovec被Spark命名為Luxturna，獲得了FDA咨詢委員會的一致認(rèn)可。該產(chǎn)品將人視網(wǎng)膜色素上皮特異性蛋白65 kDa（RPE65）cDNA遞送到雙眼視網(wǎng)膜下間隙治療視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良。在2017年10月19日，F(xiàn)DA授予了Luxturna的正式批文。

自2012年以來，血友病B（凝血因子IX缺失）的第二例臨床試驗已由A C Nathwani和其同事發(fā)起（皇家自由醫(yī)院）。在該試驗中，使用了血清型AAV8的病毒外殼以期比之前試驗中使用的AAV2獲得更高的基因表達(dá)率。關(guān)鍵的是AAV8較之AAV2在人群中的預(yù)存抗體水平更低。該實驗中，外周靜脈一次性注射表達(dá)凝血因子IX cDNA的由肝臟特異性啟動子啟動的AAV載體，能夠?qū)⒀獫{中凝血因子IX水平提升至治療水平（正常水平的1-6%），這一水平提升呈現(xiàn)劑量依賴性。高劑量注射能夠觀察到短暫的轉(zhuǎn)氨酶水平升高，隨后經(jīng)皮質(zhì)類固醇治療好轉(zhuǎn)。更多的血友病B的I/II期臨床試驗使用了天然存在的Padua亢進(jìn)突變體進(jìn)行。在這些試驗中，在兩個接受了高劑量載體注射的患者體內(nèi)觀察到了免疫反應(yīng)導(dǎo)致的轉(zhuǎn)基因表達(dá)下降，其中一個病人需要轉(zhuǎn)向傳統(tǒng)的凝血因子IX注射治療，而且從另一方面來講，盡管在10個受試者中觀察到兩個肝酶水平無癥狀的增加，但能夠通過短期皮質(zhì)類固醇治療來解決。AAV9血清型的重組AAV病毒藉治療神經(jīng)性脊髓型肌萎縮癥（SMA）162型和圣菲力波綜合征A型（MPS IIIa）走向臨床，說明這種病毒能夠有效地跨越人的血腦屏障，在小鼠模型中也獲得了一致的結(jié)果。

近年來，產(chǎn)業(yè)和分出公司對基因治療的興趣前所未有，這反映了對這一領(lǐng)域信心的增加。這些信心來源于基于治療效果的越來越多的報道和首批基因治療產(chǎn)品如EMA2012年批準(zhǔn)的Glybera?（uniQure）和2016年治療ADA-SCID的SrimoSmithLe（葛蘭素史克）的上市。更近一些，諾華研發(fā)的首個CAR T細(xì)胞治療產(chǎn)品Kymriah（之前名為tisagenlecleucel-T 和CTL019）于2017年8月獲FDA批準(zhǔn)。緊接著，由Kite Pharma研發(fā)的商品名為Yescarta的CAR-T治療產(chǎn)品和Spark Therapeutics 的Luxturna分別在10月和12月獲得FDA批準(zhǔn)上市。學(xué)術(shù)界也獲得了越來越多的行業(yè)資助，進(jìn)一步拓展了基因治療藥物的研發(fā)管線。隨著臨床思維的變革，大量的投資開始進(jìn)入基因治療領(lǐng)域，如優(yōu)化生產(chǎn)工藝以擴(kuò)大獲得治療人類疾病所需的病毒載體的生產(chǎn)規(guī)模并確保商業(yè)化的生產(chǎn)方法對新載體適用。國內(nèi)方面，五加和對中國的基因治療提供AAV、HSV、LENTI、ADV載體系統(tǒng)中試及規(guī)?；d體生產(chǎn)平臺，可以為基因治療產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展提供支撐。臨床醫(yī)藥中基因治療的信心增加也引發(fā)了生物醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)τ跐撛讷@利的疾病指征的激烈競爭，以利用AAV載體治療凝血因子缺乏的血友病A和血友病B為例，至少10家公司分別啟動或宣稱計劃開展臨床試驗。

自2012年以來，一個重要的模式變化在于更多的關(guān)注集中在基因補(bǔ)充策略的改變，包括基因編輯和目標(biāo)基因重組，反義寡核苷酸誘導(dǎo)外顯子跳躍以及RNA干擾，這些方案現(xiàn)已全部進(jìn)入臨床。在簡單增加功能正常的基因不足以改善的顯性疾病過程中，這一策略非常重要。RNAi的重要性（例如基因下調(diào)基因表達(dá)）在2006和梅洛獲得諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎時被認(rèn)可。雖然這些方法的效率通常不足以進(jìn)行人類疾病的基因治療，但在使用寡核苷酸誘導(dǎo)的外顯子跳躍治療假肥大型肌營養(yǎng)不良癥（DMD）方面和關(guān)于SMA治療的典型案例已被報道出來并在最近的分子治療周年紀(jì)念版中進(jìn)行了綜述。2016，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了兩種剪接調(diào)節(jié)寡核苷酸用于治療神經(jīng)肌肉疾病。第一個是Eteplirsen (Sarepta Therapeutics)，盡管有爭議但仍獲得了FDA的優(yōu)先審批，用磷酰二胺嗎啉反義寡核苷酸治療DMD。而用于治療SMA患者的nusinersen (由Biogen市場化的Spinraza)則在提出新藥申請后3個月就被接收，并且不需轉(zhuǎn)至FDA咨詢委員會。

自第一個特異性的核酸酶被證明能夠結(jié)合DNA并使雙鏈斷裂以來已近二十年的時間，這極大的促進(jìn)了位點特異性基因編輯的發(fā)展。核酸酶誘導(dǎo)的基因斷裂不僅可以用基因添加和基因破壞，還可用于基因修復(fù)。盡管需要長期隨訪，但基因編輯技術(shù)的前景看好，這一技術(shù)已被應(yīng)用于治療HIV-193和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶的臨床試驗中，用以治療兩個患有晚期白血病的兒童。最近，一種用于細(xì)菌免疫系的規(guī)則相間的短回文重復(fù)基因簇相關(guān)cas9（CRISPR/CAS
9）核酸酶顯著提高了基因組編輯的效率，盡管在30年前首次被報道時僅被作為iap基因下游的一組不尋常核苷酸序列。這一細(xì)菌免疫系統(tǒng)被重新定義，導(dǎo)致了基因編輯技術(shù)的持續(xù)革命。根據(jù)報道，為了生產(chǎn)更安全的異種移植組織，CRISPR/Cas9已被用于超過60種豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的滅活中。最近，CRISPR/CAS9修飾的細(xì)胞首次用于人類治療癌癥。2016年10月28日，四川大學(xué)盧鈾團(tuán)隊將CRISPR/Cas9改造的T細(xì)胞輸入病人體內(nèi)以治療轉(zhuǎn)移性肺癌（試驗號NCT02793856）,國內(nèi)還有另外7個針對實體瘤的臨床試驗計劃進(jìn)行。SangaMo療法也開始使用鋅指核酸酶將序列導(dǎo)入白蛋白位點治療粘多糖沉積癥和血友病B（試驗號分別為：NCT03041324, NCT02702115 和 NCT02695160）。盡管仍處于臨床前階段，但使用非同源末端糾正致病性剪接位點突變已被報道用于治療小鼠1A性先天性肌營養(yǎng)不良癥并在一些案例中可能最終取代使用寡核苷酸誘導(dǎo)的外顯子跳躍。該技術(shù)的進(jìn)一步改進(jìn)，如鑒定具有減少的靶向效應(yīng)的替代核酸酶，已經(jīng)顯示了其基因治療應(yīng)用的潛力，但對大量的細(xì)胞進(jìn)行精準(zhǔn)的位點修復(fù)以獲得治療效果仍是對現(xiàn)有技術(shù)的挑戰(zhàn)。最開始利用CRISPR/Cas9對人類胚胎進(jìn)行基因編輯的是中國，最近美國也有相關(guān)報道。

基因傳遞系統(tǒng)可分為兩大類：非病毒的物理化學(xué)方法與重組病毒系統(tǒng)。非病毒方法的比較優(yōu)勢包括化學(xué)特性的簡化、生產(chǎn)的簡單性和再現(xiàn)性、更大的包裝容量和能減少生物安全方面的擔(dān)憂。然而與重組病毒系統(tǒng)相比非病毒方法相對低效且往往效果短暫。然而核酸穩(wěn)定性和效力的提高以及脂質(zhì)和聚合物遞送技術(shù)的進(jìn)步，正在推進(jìn)非病毒基因遞送系統(tǒng)的發(fā)展。相較與此，為了使病毒系統(tǒng)復(fù)制能力缺失、效率更高以及更好的利用其有利的一面，病毒系統(tǒng)常有修改。根據(jù)所需修飾的性質(zhì)，核酸、寡核苷酸、適體、轉(zhuǎn)錄因子和其他分子的瞬時遞送是非常可能實現(xiàn)的。例如，使用非整合載體、瞬時表達(dá)系統(tǒng)和小分子將轉(zhuǎn)錄因子傳遞到誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS），其安全性問題的解決在于消除編碼轉(zhuǎn)錄因子不必要的長期表達(dá)和插入誘變的可能性。通過限制潛在的脫靶效應(yīng)，Cas9和其他DNA內(nèi)切酶在基因組編輯中的瞬時表達(dá)也可能是有利的，這正在被廣泛地研究。

Ginn S L, Alexander I E, Edelstein M L, et al. Gene therapy clinical trials worldwide to 2012 – an update[J]. Journal of Gene Medicine, 2013, 15(2):65.