深度長文：T細(xì)胞療法的這些細(xì)節(jié)，你全都知道嗎？

近日，一篇討論腫瘤免疫療法的文章引起了許多行業(yè)人士的關(guān)注。這篇文章發(fā)表于“腫瘤免疫療法研究趨勢”網(wǎng)站，作者是楊森制藥（Janssen Pharmaceutical Companies）的腫瘤免疫學(xué)家Nata?a Obermajer博士。在這篇文章里，作者深度討論了兩類使T細(xì)胞靶向腫瘤的方法——嵌合抗原受體（CAR）與雙特異性抗體（BsAb）。在今天的報道里，藥明康德微信團(tuán)隊也將為各位讀者整理這篇文章的核心內(nèi)容。

在最新一代的腫瘤免疫療法中，科學(xué)家們將目光投向了T細(xì)胞。利用這些細(xì)胞的腫瘤殺傷能力，我們有望設(shè)計出全新的抗癌療法。在過去的幾年里，CAR-T細(xì)胞療法與雙特異性抗體療法使T細(xì)胞能有效地靶向CD19等抗原，為罹患B細(xì)胞惡性癌癥的患者帶來了極好的緩解，也為腫瘤免疫療法領(lǐng)域帶來了革新。

盡管這些創(chuàng)新療法帶來了積極的臨床效果，但它們面臨著類似的問題：在血液癌癥中，它們有潛在的毒性風(fēng)險。而在實體瘤的治療上，它們的療效還尚未得到證實。為此，我們有必要了解這些療法背后的機(jī)理與局限，以及它們在未來的應(yīng)用潛力。

CAR是指一類人工合成的受體，它包括了細(xì)胞外的腫瘤抗原識別區(qū)域，以及一個用于細(xì)胞內(nèi)信號通路的CD3ζ區(qū)域。此外，CAR抗體還會包括1到2個共刺激域。當(dāng)其單鏈可變片段（scFv）與腫瘤發(fā)生結(jié)合后，能激活T細(xì)胞受體，從而導(dǎo)致T細(xì)胞對表達(dá)抗原的細(xì)胞產(chǎn)生反應(yīng)。

本文來源：藥明康德

去年，美國FDA批準(zhǔn)了兩款CAR-T療法上市，它們分別是諾華的Kymriah （tisagenlecleucel）與Kite Pharma（已被吉利德收購）的Yescarta（axicabtagene ciloleucel）。這兩款CAR-T療法都靶向致癌性B細(xì)胞表面的CD19抗原：前者治療B細(xì)胞急性淋巴性白血病，能取得高達(dá)83%的緩解率；后者則在B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤的治療中，取得了72%的緩解率。

在這兩款療法之外，還有不少CAR-T療法正在開發(fā)之中，它們來自Juno Therapeutics，Celgene，bluebird bio，Mustang Bio，Servier，Pfizer，Cellectis，以及Celyad等生物醫(yī)藥公司。不同研發(fā)人員開發(fā)的CAR-T療法，其CAR結(jié)構(gòu)可以很多樣化，細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域，以及細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域都能有所區(qū)別。

▲CAR分子的一些設(shè)計（圖片來源：參考資料[2]）

最近，一些新藥研發(fā)人員也正在設(shè)計全新的CAR。其中一些CAR-T細(xì)胞能特異性靶向腫瘤微環(huán)境，以克服腫瘤的免疫抑制效果。舉例來說，IL4R細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與IL7R細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的融合，可以靶向細(xì)胞因子，從而讓T細(xì)胞在抑制性細(xì)胞因子IL4存在的情況下，依然可以得到激活和增殖；此外，表達(dá)趨化因子受體CCR2b的CAR-T細(xì)胞也能靶向腫瘤表面高度表達(dá)的CCL2；一些CAR能靶向腫瘤血管上過量表達(dá)的VEGFR2或αvβ3，增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞對腫瘤的穿透能力；還有一些新穎的療法可以將CAR-T細(xì)胞作為特定細(xì)胞因子或共刺激因子的遞送者，增強(qiáng)內(nèi)源效應(yīng)T細(xì)胞的浸潤。

在CAR之外，另一個使用單鏈可變片段（scFv）技術(shù)的新領(lǐng)域是雙特異性抗體。在上世紀(jì)80年代中期，人們造出了首個能將T細(xì)胞導(dǎo)向特定抗原的雙特異性抗體。自那以后，雙特異性抗體領(lǐng)域取得了快速的發(fā)展。到2017年，這一領(lǐng)域的論文總數(shù)已經(jīng)超過了2500篇。目前，絕大部分的雙特異性抗體是通過DNA重組技術(shù)來生成的，而通過化學(xué)方法將兩個單克隆抗體進(jìn)行交聯(lián)的技術(shù)也在一些研究中證明了其可行性。在這一領(lǐng)域的蓬勃發(fā)展下，大量雙特異性抗體正在臨床前和臨床試驗中驗證它們的潛力。通過將T細(xì)胞直接引導(dǎo)至靶向細(xì)胞，這些T細(xì)胞的激活將不受MHC的限制，也不需要依賴于天然T細(xì)胞受體的特異性。

雙特異性抗體的構(gòu)型有許多種。一些研究表明，針對某些特定的抗原，某種構(gòu)型可能表現(xiàn)更佳。但通常意義上說，一種結(jié)構(gòu)是不足以滿足所有需求的。這是因為單克隆抗體的互動、抗原上的表位位置、以及抗原在靶向細(xì)胞表面的密度與運(yùn)動性，都會影響到T細(xì)胞的激活。

▲一些雙特異性抗體的設(shè)計（圖片來源：參考資料[3]）

在諸多雙特異性抗體中，許多研究人員對雙特異性T細(xì)胞接頭（BiTEs）有獨(dú)特的興趣。這是一類重組的雙特異性蛋白，具有兩個相連的單鏈可變片段，其中一個靶向T細(xì)胞表面的分子（如CD3ε），另一個靶向癌細(xì)胞表面的抗原。這兩種單鏈可變片段被靈活地連接在一起。

2014年，美國FDA批準(zhǔn)了能夠針對CD19的BiTE分子Blincyto?（blinatumomab），用于費(fèi)城染色體陰性的復(fù)發(fā)或難治性B細(xì)胞前體急性淋巴性白血?。ˋLL）的治療。Blinatumomab由VL-VH向的抗CD19單鏈可變片段，與VH-VL向的抗CD3單鏈可變片段，通過G4S連接。由于分子體積較小，這些BiTE的半衰期只有1.25小時。為了克服這一限制，人們正在研究一些新的方法，譬如將BiTE連接到重鏈片段，或是做出其他新的設(shè)計，以提高它在血清里的半衰期。此外，它也能通過連續(xù)的輸注治療，確保體內(nèi)的濃度。

本文來源：藥明康德

最近，行業(yè)對BiTE的體內(nèi)制造產(chǎn)生了興趣。其一大策略是通過基因改造的T細(xì)胞來產(chǎn)生BiTE，這能克服其半衰期較短的問題。另一種方法是使用溶瘤病毒來表達(dá)BiTE。與此同時，研究人員們也指出了BiTE的一大挑戰(zhàn)：它的活性取決于腫瘤部位的T細(xì)胞種類和密度。倘若這些T細(xì)胞都已經(jīng)耗竭，或都是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，就會影響到BiTE的效果。

另一種雙特異性抗體——雙鏈抗體（diabody）是由兩條鏈組成的雙價分子，每一條鏈都具有VH和VL結(jié)構(gòu)域。在雙鏈抗體中，兩個可變結(jié)構(gòu)域通過較短的連接子（如G4S）相連。也正是由于這些連接序列較短，雙鏈抗體無法通過鏈內(nèi)重組形成抗原結(jié)合位點。相反，這兩條鏈會以“頭-尾”的方向形成雙聚體，成為一個緊實的分子。如果在同一個細(xì)胞內(nèi)同時表達(dá)這兩條鏈，就有望產(chǎn)生雙特異性的異體雙聚體，帶來相應(yīng)的可變域（VHA-VLB / VHB-VLA，或VLA-VHB / VLB-VHA）。但此類雙鏈抗體的一個潛在問題在于，如果形成同源雙聚體，則無法帶來正確的可變域（VHA / VLB或VHB / VLA）。一個替代做法是在這兩條鏈的C端上，將半胱氨酸共價鏈接，即雙親性重靶向蛋白（dual-affinity retargeting proteins, DART）。

T細(xì)胞的亞群：在CAR-T細(xì)胞療法中，CD4陽性和CD8陽性的T細(xì)胞經(jīng)常被混在一起進(jìn)行基因編輯，插入CAR，再被輸注回患者體內(nèi)。盡管CD8陽性的T細(xì)胞被認(rèn)為是殺傷癌細(xì)胞的主力軍，但CD4陽性的T細(xì)胞在裝備了CAR之后，同樣能被激活，并顯示出細(xì)胞裂解的活性。同樣，在與BiTE分子共同培育時，CD8和CD4陽性的T細(xì)胞也都能被激活，誘導(dǎo)靶向腫瘤細(xì)胞的死亡。其中的區(qū)別在于CD8陽性的T細(xì)胞殺傷速度更快。

T細(xì)胞的表型：現(xiàn)在我們知道，分化水平越低的CAR-T細(xì)胞，在體內(nèi)的療效越好。因此，研究人員們期望能盡量產(chǎn)生TSCM（stem memory T cell）與TCM（central memory T cell），并對其保持維持。但在BiTE領(lǐng)域，我們需要不同的T細(xì)胞類型。初始T細(xì)胞在BiTE的作用下，無法被激活。因此， BiTE介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，需要和共刺激信號通路無關(guān)的T細(xì)胞群體參與。

本文來源：藥明康德

連接的結(jié)構(gòu)域：由BiTE與CAR介導(dǎo)的T細(xì)胞-靶向細(xì)胞的結(jié)合在形式上有所不同。這可能是因為BiTE涉及到了天然的CD3復(fù)合體。對于BiTE來說，腫瘤相關(guān)抗原表位與靶向細(xì)胞膜之間的距離，決定了它的活性。這可能是不同雙特異性抗體療效產(chǎn)生差異的原因。

T細(xì)胞的擴(kuò)增：CAR-T細(xì)胞在擴(kuò)增后，可達(dá)到體內(nèi)循環(huán)淋巴細(xì)胞的20%之多。而對于BiTE來說，大量曾接觸過抗原的T細(xì)胞能直接加以利用，從而減少了對于細(xì)胞擴(kuò)增的依賴。相比CAR-T細(xì)胞動輒擴(kuò)增1000倍以上，在一些BiTE案例中，T細(xì)胞只需擴(kuò)增2-4倍。這一特性有望讓BiTE在實體腫瘤的治療上更具優(yōu)勢。當(dāng)然，這需要建立在對實體瘤進(jìn)行良好穿透的前提下。

親和性：最初，人們認(rèn)為較低的CD3親和性（KD ～ 10 ^ -7M或以上）能避免非特異性的T細(xì)胞激活。這是因為高親和性（KD ～ 10 ^ -9M - 10 ^ -8M或以下）的二價CD3結(jié)合可能會帶來非靶向特異的T細(xì)胞激活。但后續(xù)的研究則表明這些非特異的激活可能與抗體的交聯(lián)有關(guān)，而非二價結(jié)合的直接后果。

作者在文章中指出，在T細(xì)胞療法領(lǐng)域，未來主要的幾大策略包括：

• 通過提供積極的刺激，或是對免疫檢查點進(jìn)行抑制，增強(qiáng)臨床上的抗腫瘤效果

• 尋找到創(chuàng)新的靶點，以克服實體腫瘤微環(huán)境導(dǎo)致的耐受，或是克服惡性血液癌癥中由于抗原表達(dá)下調(diào)而導(dǎo)致的獲得性耐受

• 尋找到T細(xì)胞的新來源，如異體的通用型T細(xì)胞療法

• 精準(zhǔn)地調(diào)控效應(yīng)細(xì)胞，以限制療法的毒性

先進(jìn)的CAR工程化技術(shù)有望能拓展CAR的結(jié)合能力，讓其靶向多種不同的抗原。如果CAR-T細(xì)胞能結(jié)合兩種抗原，并只有在同時結(jié)合的情況下才被激活，則有望為這一療法帶來革新。作者指出，這些細(xì)胞能先通過第一代CAR技術(shù)結(jié)合第一種抗原，產(chǎn)生第一個信號。接著，通過設(shè)計一款嵌合的共刺激CAR（只在沒有CD3ζ的情況下發(fā)生共刺激），第二款抗原能產(chǎn)生第二個信號。在實體瘤領(lǐng)域，類似的腫瘤相關(guān)抗原的“雙靶向”策略有望增強(qiáng)T細(xì)胞的選擇性，拓展應(yīng)用前景。為了確保這種方法能取得成功，我們必須對腫瘤相關(guān)抗原進(jìn)行仔細(xì)的選擇，確保它們在細(xì)胞表面存在或表達(dá)。

最近的一些新型CAR設(shè)計保留了CAR的骨架，但使用了單鏈可變片段之外的結(jié)構(gòu)域。比如有些公司使用的是CD16的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，一些公司開發(fā)的T細(xì)胞表達(dá)有自然殺手細(xì)胞的受體（NKG2D），以靶向8種不同的腫瘤配體。

本文來源：藥明康德

另一些公司正在嘗試使用不同的T細(xì)胞。比如bluebird bio和蘇格蘭的生物技術(shù)公司TC Biopharm合作，利用gamma delta T細(xì)胞，開發(fā)針對實體瘤的CAR-T療法。按設(shè)想，這種療法能選擇性地靶向癌細(xì)胞，而不會攻擊健康細(xì)胞，從而顯著降低毒性。

還有一類新穎的設(shè)計是使用藥物分子去激活CAR。在這類設(shè)計中，CAR的信號元件被分成了幾大塊。只有在某種藥物存在的前提下，它們才會聚集在一起產(chǎn)生信號。由Cellectis授權(quán)給Servier與輝瑞（Pfizer）的UCART19就具有類似的開關(guān)。只有在rapamycin存在的情況下，CAR-T才會被激活。Bellicum Pharmaceuticals的GoCAR-T療法同樣應(yīng)用了類似的技術(shù)，激活它的藥物是rimiducid。

在對T細(xì)胞的激活進(jìn)行調(diào)控之外，行業(yè)里的另一個熱點是開發(fā)終止CAR-T細(xì)胞功能的開關(guān)，以限制其短期或長期的毒性。這一般要求在CAR的設(shè)計中插入“自殺基因”，以在特殊藥物分子的作用下，特異性地摧毀這些細(xì)胞，控制副作用。其中，一些裝有自殺基因的T細(xì)胞療法已經(jīng)進(jìn)入了臨床試驗階段，其中一類表達(dá)有HSV-TK，一類表達(dá)有iCASP9。前者能被ganciclovir激活，“自殺”效果較好，但其免疫原性可能會限制其應(yīng)用（因為它來自于皰疹病毒的胸苷激酶）；后者則是將突變的FKBP12與caspase 9的催化結(jié)構(gòu)域相融合，它的免疫原性較好。

在本文的最后，作者指出CAR-T細(xì)胞療法與雙特異性抗體在不同的臨床試驗中，各自有其表現(xiàn)出眾的地方。值得一提的是，這兩種療法在作用機(jī)制上各有千秋，如果患者無法從一種療法上得到緩解，不代表他們無法從另一種療法上受益。事實上，有兩名患者在接受了blinatumomab的治療后病情復(fù)發(fā)，但卻在靶向同一抗原的CAR-T療法治療后達(dá)到完全緩解。未來，我們需要更加深入地了解兩類療法的優(yōu)勢，并考慮組合使用的可能。

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參考資料：

[1] Bridging T cells to Tumors: CARs vs BsAb. Retrieved August 9, 2018 from https://www.immuno-oncologyresearchtrends.com/home/2018/7/21/cancer-re-direction-and-t-cell-therapies-cars-vs-bites-or-tcr-and-immtacs

[2] Zhukovsky et al., (2016) Bispecific antibodies and CARs: generalized immunotherapeutics harnessing T cell redirection, Current Opinion in Immunology, https://doi.org/10.1016/j.coi.2016.02.006

[3] Velasquez et al., (2018) Redirecting T cells to hematological malignancies with bispecific antibodies, Blood, https://doi.org/10.1182/blood-2017-06-741058