干細胞療法治療糖尿?。哼M展與挑戰(zhàn)

一個世紀以前，1型糖尿病意味著死刑。現(xiàn)在，它只是日常病。著名國際期刊《Cell Stem Cell》刊登了一篇綜述，這篇綜述闡述了干細胞治療糖尿病的關(guān)鍵技術(shù)和核心問題。文章從如何生成功能完整的胰島，胰島細胞移植中存在的免疫問題，再到干細胞微囊化的未來方向與策略。是一篇值得學(xué)習(xí)的好文章。

干細胞與糖尿病

近一個世紀以來，重組胰島素合成和給藥方式的進步從根本上降低了糖尿病相關(guān)疾病的發(fā)病率和死亡率。盡管如此，全世界仍有4億的病人因糖尿病并發(fā)癥而遭受著致命的影響，如糖尿病腎病、眼病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。嚴格的飲食控制，可以減緩或預(yù)防I、II型糖尿病并發(fā)癥的發(fā)展。遺憾的是，這種嚴格的飲食控制也會引起低脂血癥，因而措施的實施也受病人狀況的限制。通過實體胰腺器官移植或胰島移植的方法來替代β細胞，都可以達到不使用胰島素而使病情獲得良好控制的目的。由于胰島組織的來源有限，因此，用干細胞生產(chǎn)出充足的分泌胰島素的細胞資源，將可以滿足β細胞替換、達到胰島素非依賴的廣泛需求。 

干細胞技術(shù)的發(fā)展，組織工程的進步再加上生物材料的發(fā)展，使得其離臨床轉(zhuǎn)化越來越近，成為最有潛力的糖尿病替代治療策略。然而，干細胞治療糖尿病關(guān)鍵技術(shù)和核心問題仍有待深入研究和克服。

如何生成功能完整的胰島

近十余年，用人源干細胞生產(chǎn)功能性β細胞取得了顯著的進展。基本策略是重演了胚胎時期多能干細胞分化的主要路徑：形成明確的內(nèi)胚層，然后胰腺內(nèi)胚層，再到內(nèi)分泌前體細胞（祖細胞）并最終形成胰島細胞。最近的研究重點在生產(chǎn)對葡萄糖刺激產(chǎn)生響應(yīng)并分泌胰島素的單個細胞上。幾個研究室的精力集中在生產(chǎn)功能完整的β細胞和胰島細胞，并且很快可以作為胰島素分泌細胞的資源來替代人的胰島。

圖-1 胰腺由外分泌和內(nèi)分泌區(qū)域組成。后者由稱為朗格漢斯島(Inset)的小球樣微型器官組成。每個胰島都含有分泌胰島素的β細胞，以及其他分泌激素的內(nèi)分泌細胞(α、δ、epsilon和PP細胞)。所謂的“中心”細胞是β細胞的一個亞群，它協(xié)調(diào)胰島細胞在葡萄糖刺激后協(xié)同釋放胰島素。內(nèi)分泌細胞不是孤立存在的，而是存在于各種細胞組成的小生境中：包括基質(zhì)細胞、神經(jīng)細胞、內(nèi)皮細胞和血管周細胞。

盡管從人源胚胎干細胞制備胰島素分泌細胞取得了明顯的進展，但完美地復(fù)制內(nèi)源β胰島細胞所有特點并實現(xiàn)其所有功能的細胞形成過程仍然有待闡明?？紤]到機體內(nèi)的β胰島細胞不是獨立存在的，而是處于錯綜復(fù)雜的3D胰腺環(huán)境中，因此制備“完整”的胰島細胞應(yīng)當(dāng)有助于胰腺功能重建。事實上，β細胞功能的維持高度依賴于胰島復(fù)雜的細胞結(jié)構(gòu)，而分離態(tài)的胰島細胞與完整結(jié)構(gòu)中的胰島細胞的行為不同。比如，由于基礎(chǔ)胰島素分泌量和葡萄糖刺激下最大胰島素分泌量下降，分離態(tài)的β細胞跟完整結(jié)構(gòu)狀態(tài)中的細胞相比，其葡萄糖刺激下的胰島素分泌功能低下。加之其它機制，像細胞-細胞信號交流的協(xié)調(diào)、細胞間隙連接蛋白Connexin-36等均在維持胰島素水平波動中與β細胞聯(lián)結(jié)和胰島同步過程發(fā)揮重要作用。

考慮生產(chǎn)最理想效果的治療糖尿病治的人胚胎干細胞，所以制備細胞時必須考慮如何重建胰島細胞與細胞的接觸和胰島與微環(huán)境交流的結(jié)構(gòu)。

β細胞另外一個主導(dǎo)性功能是與胰島小生境中其它細胞的信息交流，包括多種非內(nèi)分泌型細胞，如內(nèi)皮細胞、周細胞、神經(jīng)細胞和間充質(zhì)細胞。特別是，胰腺中胰島的血管高度發(fā)達，可能每一個β細胞都與內(nèi)皮細胞產(chǎn)生一個或多個接觸，并在接觸處形成特殊的超微結(jié)構(gòu)。在胰腺發(fā)育過程中，內(nèi)皮細胞最初被內(nèi)分泌細胞分泌的VEGF-A招募到迅速生長的胰島。然后是內(nèi)皮細胞合成和分泌胰島膜基質(zhì)，并作為β細胞生長、存活和功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。Otonkoski團隊研究表明，人胰島中圍繞內(nèi)皮細胞和β細胞出現(xiàn)二個基膜。鑒于在自然環(huán)境中β細胞與支持細胞之間的特殊關(guān)系，在體外重塑內(nèi)源性β細胞小生境中某些元素可能促進hESC衍生β細胞的存活和功能。

胰島血管小生境不僅包括內(nèi)皮細胞，還包括壁細胞，稱為周細胞。周細胞包裹在內(nèi)皮細胞管周圍，以提供結(jié)構(gòu)支持和產(chǎn)生成熟功能的血管并調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的增殖、存活和功能。周細胞在正常胰島功能中的作用還不完全清楚，而遺傳敲除研究則表明，成年鼠胰島中周細胞的缺失會導(dǎo)致胰島素表達和葡萄糖清除的障礙。

鑒于胰島細胞結(jié)構(gòu)對內(nèi)分泌功能的重要性，可以設(shè)計培養(yǎng)系統(tǒng)來再現(xiàn)發(fā)育過程中胰島復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)的諸要素。各種方法被用于體外產(chǎn)生工程胰島，或所謂的‘假胰島’。多項研究報告表明，無論是在體外還是在體內(nèi)，移植了假胰島的再聚體之后，功能都得到了改善。也有證據(jù)表明，與僅由β細胞組成的假胰島相比，β細胞與內(nèi)皮祖細胞重新聚集在一起后，GSIS（葡萄糖刺激的胰島素分泌）得到了改善。

圖-2.webp.jpg圖-2 用人多能干細胞(hPSCs)生產(chǎn)β樣細胞涉及到促進多能干細胞通過一系列中間祖細胞的階段。在完成定向分化后，可以被解離β樣細胞簇并重新聚集成確定大小和組成的胰島樣細胞團。與其他類型內(nèi)分泌細胞(它們本身可能來自hPSCs)的再聚集可能改善葡萄糖自我平衡功能，可能是通過某些hPSC衍生的β細胞向中心細胞的分化。最后，內(nèi)分泌細胞可以隨小生境細胞一起重新聚集，更緊密地再現(xiàn)對β細胞功能至關(guān)重要的局部微環(huán)境的相互作用。

總之，確定最適合人體胰島功能的細胞組成和結(jié)構(gòu)布局，仍需要做更多的工作?？赡艿奶魬?zhàn)包括確定如何獲得所需的人胰島小生境中的種子細胞，特別是考慮到某些細胞類型缺乏真正具體的標記，而且來源有限。一種選擇是從hESCs或誘導(dǎo)多能干細胞(ipsCs)中產(chǎn)生這些細胞。另一個挑戰(zhàn)是，目前創(chuàng)建人工胰島的技術(shù)依賴于內(nèi)分泌細胞和非內(nèi)分泌細胞之間的自組織特性。也許有一天，胰島組織的3D打印或許成為可能，從而能夠完成所希望的結(jié)構(gòu)。

胰島細胞治療中存在的免疫問題

最近使用β細胞替代治療T1D的成功，再加上hESC-或ipsC衍生β細胞的生產(chǎn)，為有效治療該疾病提供了路線圖。然而，免疫系統(tǒng)問題仍然是廣泛采用細胞替代療法治療T1D和部分T2D患者的主要障礙。目前的免疫抑制劑是有效的，但需要終生治療，而且在許多情況下會產(chǎn)生副作用和毒性，因此多數(shù)采用這種治療策略時仍限于非常嚴重的病例。

1）首先是同種免疫排斥的問題。

在T1D患者中，移植的異基因β細胞面臨同種免疫介導(dǎo)的排斥反應(yīng)，如果不被抑制，可以在幾天內(nèi)清除移植的細胞。T細胞是同種免疫的主要因素，其激活是由于T細胞受體(TCR)識別主要組織相容性復(fù)合物(MHCs)結(jié)合的抗原肽所致。MHC蛋白的高度多態(tài)性(在人類中稱為人類白細胞抗原HLAs)是異基因免疫攻擊的主要靶點，次要組織相容性抗原，如女性受體中出現(xiàn)的男性抗原或線粒體抗原，盡管速度較慢，也能引起排斥反應(yīng)。

雖然免疫抑制保護移植物免受排斥，但廣泛的免疫抑制損害了患者的免疫系統(tǒng)，使他們?nèi)菀资艿礁腥竞蛺盒?/span>腫瘤的侵襲。一種理想的策略是訓(xùn)練免疫系統(tǒng)接受移植的細胞，避免慢性全身免疫抑制。許多臨床前動物模型已經(jīng)實現(xiàn)了對移植組織的免疫耐受，目前，正在為人類開發(fā)潛在的耐受性療法。

在過去的20年中，人們一直在共同努力研究誘導(dǎo)移植耐受性的策略，其中策略之一就是：構(gòu)建供者-受體造血嵌合體。供體免疫細胞的存在，將培養(yǎng)受體免疫細胞接受供體來源的細胞作為自身細胞，從而防止移植排斥。這種方法的一個挑戰(zhàn)是混合嵌合狀態(tài)的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致宿主或供體免疫系統(tǒng)失衡而被一方主導(dǎo)并接管。當(dāng)供體細胞占優(yōu)勢時，移植物抗宿主病的風(fēng)險就很高；當(dāng)受體細胞占上風(fēng)時，對供體的耐受性往往會喪失。另一種策略是：用過繼細胞療法促進Tregs功能。過繼性Treg治療的一個挑戰(zhàn)是，大量的可對供體反應(yīng)的效應(yīng)T細胞可以壓倒Treg介導(dǎo)的抑制。用Tregs控制排斥反應(yīng)，需要減少受體體內(nèi)針對供體產(chǎn)生反應(yīng)的T細胞。不斷有新的臨床前結(jié)果表明，Treg細胞治療可以穩(wěn)定造血嵌合體，因此，這兩種療法有可能協(xié)同作用，以實現(xiàn)更可靠和持久的耐受性。

2）其次是自身免疫的問題。

在T1D患者中，胰島自身抗原特異性T細胞也可以攻擊和破壞移植的β細胞，從而促使移植的β細胞被排斥?？刂芓1D患者自身免疫復(fù)發(fā)而排斥移植β細胞的策略，可以采取在研究控制T1D患者自身免疫中使用的措施。

已經(jīng)做了廣泛的研究工作使得T1D患者恢復(fù)自我免疫耐受。有趣的是，許多通常用來預(yù)防移植排斥的免疫抑制藥物并不能有效地誘導(dǎo)糖尿病的緩解。然而，大多數(shù)常用于預(yù)防同種免疫介導(dǎo)的移植排斥的免疫抑制藥物，都可導(dǎo)致短期糖尿病緩解，但沒有長期療效。在免疫抑制的胰腺和腎移植受者中，傳統(tǒng)藥物用于抑制自身免疫反應(yīng)，也觀察到攻擊胰島細胞的自身免疫復(fù)發(fā)。T細胞和B細胞靶向治療，如抗CD3，Abatacept (類似于上述的CTLA-4Ig分子)和抗CD-20，可使一些新的T1D患者的β細胞功能暫時停止下降。抗胸腺細胞球蛋白是一種在器官移植中常用于誘導(dǎo)T細胞衰竭的藥物，在高劑量時不能防止β細胞丟失，低劑量與G-CSF聯(lián)合使用時具有短期效益。相反，另一種T細胞靶向劑LFA-3Ig(Alefacept)能穩(wěn)定新發(fā)疾病患者的β細胞質(zhì)量。抗CD3、Abatacept和alefacept的共同之處在于，它們對效應(yīng)T細胞具有相對的選擇性，同時保留甚至增強Tregs。因此，它們的治療效果可能是由于能夠在阻止效應(yīng)T細胞的同時促進Treg的功能。這些在控制胰島自身免疫攻擊效果的提示，為設(shè)計更有效的聯(lián)合療法，以誘導(dǎo)長期耐受性提供了指導(dǎo)。

表-1 用于同種免疫和自體免疫反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)藥物。

除了上述廣泛的免疫調(diào)節(jié)策略外，也有研究持續(xù)努力地發(fā)展胰島抗原特異性治療方法。臨床前的數(shù)據(jù)表明，用胰島主要抗原制備的肽疫苗或納米微?？梢园邢蛴谔囟ǖ男?yīng)細胞來誘導(dǎo)免疫耐受，但這些策略在患者中的有效性仍有待臨床試驗證明。雖然這些研究中有許多已經(jīng)在少數(shù)病人群體中顯示了一些效果，并且有幾個項目正在進行新抗原治療的嘗試，但確定精確的抗原、時間和給藥方法是至關(guān)重要的，以期最大限度和有效地測試療效。抗原特異性免疫治療面臨的挑戰(zhàn)是免疫系統(tǒng)所針對的胰島抗原的數(shù)量；僅解除針對一種或一群胰島抗原特異性T細胞的殺傷功能不足以改變疾病的進程。此外，在不同的患者、不同的疾病階段，胰島抗原的特異性可能是不同的，因此很難知道哪些特異胰島抗原才是目標。誘導(dǎo)主要抗原特異的免疫調(diào)控的方法可能更有效，更容易應(yīng)用于不同的患者群體。

Treg細胞治療提供了許多有吸引力的特點，關(guān)乎效應(yīng)T細胞對主要抗原特異性反應(yīng)的調(diào)節(jié)。例如，Tregs通過‘關(guān)聯(lián)抑制’和‘傳染性耐受’來控制不希望的免疫反應(yīng)。在關(guān)聯(lián)抑制中，由一個抗原激活的Tregs可以抑制在同一組織微環(huán)境中出現(xiàn)的針對其它抗原的反應(yīng)。在傳染性耐受中，Tregs創(chuàng)造了一個耐受性組織微環(huán)境，從而使附近其它的激活T細胞采取調(diào)節(jié)而不是效應(yīng)命運。這使得Tregs的抑制性能夠隨著時間的推移而傳播，而不僅僅局限于起始細胞的存在。這些特性確保特異性有限的Tregs能夠?qū)植科渌庖呒毎M行特異、顯著和持久的控制。的確，單次注射胰島抗原特異性Tregs可誘導(dǎo)自身免疫性非肥胖糖尿病小鼠糖尿病終生的緩解。目前，Treg細胞治療T1D患者的早期試驗正在進行中，顯示了這種方法在患者中的可行性和安全性。

干細胞微囊化的未來方向與策略

干細胞可改善和治療諸多疾病是不爭的事實。本文前面對干細胞來源胰島細胞的生產(chǎn)和面臨的免疫障礙進行了介紹，而實際面臨的進展和挑戰(zhàn)要更麻煩。比如，臨床上，胰島移植的技術(shù)越來越成熟，對移植位置和血供等等的研究使得胰島移植成為治療的金標準；患者健康狀況也需考慮，以保證臨床治療手段可得到滿意的臨床療效。

由于干細胞生產(chǎn)的β細胞越來越接近內(nèi)源性細胞的特點，使之臨床應(yīng)用越來越靠譜，然而，免疫排斥的困難仍不容小覷。用基因編輯的方法來剔除免疫相關(guān)基因來減低免疫排斥或提升免疫耐受，但是，由于細胞復(fù)雜、相互關(guān)聯(lián)和制約的關(guān)系，容易造成免疫系統(tǒng)失衡，仍需要深入和謹慎的考量和抉擇。

采用組織工程的方法把胰島素分泌細胞包裹到特殊材料的微型膠囊裝置里，一方面可以提供胰島素分泌細胞，另一方面可以限制免疫細胞的攻擊。雖然實際操作過程中，也面臨了諸多的復(fù)雜問題，尤其是技術(shù)實現(xiàn)手段的問題，但仍有臨床實驗產(chǎn)品的推出。因此，前景依然看好。

干細胞微囊化已經(jīng)進入臨床試驗階段。2014年，第一例基于ESC治療1型糖尿病產(chǎn)品的進入臨床試驗（NCT02239354），命名為VC？01（ViaCyt公司），是hESC衍生的胰腺內(nèi)胚層細胞（稱為PEC？01細胞），是一種皮下注射植入式半滲透釋藥裝置，可以免疫隔離，允許氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)通過。這是一項開放性的1/2期臨床試驗，評估了糖尿病治療候選藥物PEC-Encap 的安全性、耐受性以及療效。還有另一個臨床試驗（NCT01652911），這產(chǎn)品不能進行免疫隔離，將其植入皮膚下血管處30天后，隨后再植入胰島細胞。這項為期3年的臨床試驗在招募了3個患者之后中終止了。

總的來說，相關(guān)學(xué)科快速的進展，為糖尿病患者治療提供了新的可期待的治療途徑。盡管這些領(lǐng)域仍有不小的技術(shù)障礙，但新的膠囊技術(shù)、新的免疫調(diào)節(jié)方法、干細胞分化方法的改進和基因編輯手段的結(jié)合應(yīng)用，新技術(shù)將給T1D和T2D患者帶來了革命性的現(xiàn)代細胞治療方法。