眾所周知，癌癥是一類嚴重危害大眾健康的慢性病。2020年3月國家衛(wèi)健委發(fā)布的《癌癥防治核心信息及知識要點》顯示，我國每年新發(fā)癌癥病例超過350萬，死亡病例超過200萬，防控形勢嚴峻。
癌癥是一類由基因突變以及轉(zhuǎn)錄、表觀遺傳和蛋白質(zhì)組學(xué)的變化引起的多基因疾病，這些變化可以作為早期篩查、診斷和個體化治療的重要生物標志物。例如，幾種已知致癌基因（例如EGFR、HER2、KRAS）和腫瘤抑制基因（例如TP53、PTEN、PI3K）的突變已被用作生物標志物，指導(dǎo)乳腺癌、卵巢癌、肺癌和前列腺癌等疾病的治療。
癌癥的早期篩查和早期治療對于提高患者的生存和生活質(zhì)量至關(guān)重要，一旦惡性腫瘤患者病情進入中晚期，治愈率會大大降低。傳統(tǒng)的癌癥檢測方法如組織活檢等存在侵入性、操作繁瑣等情況，不利于推動癌癥早篩工作。
于是，大家的目光轉(zhuǎn)向了液體活檢。
液體活檢是重要的癌癥早篩工具
已有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞所釋放出的生物標志物能進入體液，研究人員可以從中提取腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵信息用于分析，由此液體活檢技術(shù)應(yīng)運而生。相較于組織活檢，液體活檢的優(yōu)勢在于非介入性、可重復(fù)、操作方便、能及時反映腫瘤細胞發(fā)展的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)尚在早期的腫瘤，為腫瘤早篩提供了有效的途徑。
近幾年在全球范圍內(nèi)，癌癥早篩成為熱門的研究和應(yīng)用領(lǐng)域。下一代測序（NGS）的廣泛應(yīng)用顯著地促進了血液、尿液、唾液、胸腔積液和腦脊液（即液體活檢）中癌癥生物標志物的發(fā)現(xiàn)。利用NGS對整個基因組或數(shù)千個突變同時進行高效測序，可以作為生物標志物檢測和發(fā)現(xiàn)的有力工具。同時，在國內(nèi)也有眾多企業(yè)開始布局癌癥早篩領(lǐng)域，并進行產(chǎn)品轉(zhuǎn)化。
液體活檢的腫瘤生物標志物
液體活檢作為體外診斷的重要分支，通過捕獲和檢測血液、尿液、唾液、腹水、胸膜積液等液體活檢中的生物標記物來診斷和監(jiān)測腫瘤等疾病。
液體活檢所檢測的腫瘤生物標志物包括游離核酸（cfDNA/cfRNA）、細胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EV）、循環(huán)腫瘤細胞（Circulating Tumor Cell，CTC）等。
一、 游離核酸
游離核酸（cfDNA/cfRNA）是循環(huán)于體液中而游離于細胞外的核酸，主要是機體內(nèi)的細胞程序性死亡后裂解所釋放出的DNA或者RNA。
cfDNA（cell free DNA）
cfDNA是液體活檢領(lǐng)域廣泛檢測的對象，尤其是游離在體液中的循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）。ctDNA來源于凋亡或壞死的腫瘤細胞，是惡性腫瘤的特征。外周血中的ctDNA包含了癌基因/抑癌基因的突變、微衛(wèi)星不穩(wěn)定、后生遺傳學(xué)變異等基因變異信息，現(xiàn)階段主要通過高通量測序技術(shù)檢測分析這些信息并應(yīng)用于臨床。
在腫瘤早期篩查研究領(lǐng)域，ctDNA一直是各大廠商、科研工作者關(guān)注的重點。
cfRNA（cell free RNA）
cfRNA，是存在于人體循環(huán)系統(tǒng)中的一些內(nèi)源性或外源性微量RNA片段，包括mRNA、miRNA和lncRNA等。
科研人員發(fā)現(xiàn)，單純的ctDNA檢測不能全面反映疾病在RNA水平的生物活性，無法明確突變對細胞進程的影響。而RNA水平的檢測能明確癌癥在特定時間發(fā)生的變化，可定期監(jiān)控疾病的發(fā)展及對治療的反應(yīng)，并預(yù)測身患同一癌癥的不同個體將對不同療法有何反應(yīng)，因此受到廣泛關(guān)注。
二、 細胞外囊泡
細胞外囊泡（EV）是細胞在靜息或應(yīng)激狀態(tài)下釋放的各種具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡總稱，主要由外泌體、微囊泡和凋亡小體組成，廣泛存在于細胞培養(yǎng)上清以及血液、尿液等體液中，被認為是潛在的生物標志物。
三、 循環(huán)腫瘤細胞
循環(huán)腫瘤細胞（CTC），是指從實體瘤中脫離出來并進入外周血液循環(huán)的腫瘤細胞，CTC數(shù)目往往很少。
目前對游離核酸（cfDNA、cfRNA）的應(yīng)用比較成熟。各大檢測服務(wù)提供商、科研工作者對游離核酸的關(guān)注一直十分強烈。不少液態(tài)活檢研究人員開始同時檢測cfDNA與cfRNA兩個水平的變化，聯(lián)合分析提供更全面的臨床數(shù)據(jù)。但是，在開發(fā)游離核酸檢測項目時，研發(fā)人員常面臨多種挑戰(zhàn)：
1. 游離核酸在外周血中含量較低。
2. 游離核酸穩(wěn)定性、完整性不足，存在一定程度降解。
3. 建庫流程較長，操作繁瑣，對實驗員素質(zhì)有更高要求。
對以上困難點，通?？紤]從兩個方面進行解決：當(dāng)核酸含量不足時，可以選擇一些更好的核酸提取技術(shù)，也可以選擇低起始量的文庫構(gòu)建方案；對于核酸品質(zhì)差，降解嚴重的樣本，可以選擇兼容低品質(zhì)核酸的文庫構(gòu)建技術(shù)。綜合看來，選擇能支持微量核酸起始、兼容不同品質(zhì)核酸的文庫構(gòu)建技術(shù)能夠一次解決上述所有問題。
Takara的可用于cfRNA、cfDNA的NGS解決方案，可以從容面對游離核酸項目研發(fā)遇到的各種瓶頸。
cfRNA文庫構(gòu)建
SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalian（Pico v3）
Pico v3如何解決FFPE、cfRNA樣本降解，微量建庫的難題：
Pico v3支持250 pg-10 ng total RNA起始，即使珍貴的微量臨床樣本，也無需過于擔(dān)心樣本量不足。
支持RIN2-10或DV200≥25%的RNA起始，無論是品質(zhì)較好還是高度降解的cfRNA樣本，都能生成優(yōu)質(zhì)的文庫。
創(chuàng)新性地引入了ZapR Rprobes的核糖體去除技術(shù)，無需提前處理rRNA，便可在建庫過程中識別、切斷核糖體來源的cDNA，最終能在7.5h 內(nèi)完成鏈特異性Illumina文庫的構(gòu)建。
通過添加UMI，Pico v3可以靈敏地識別PCR重復(fù)片段并校正PCR擴增錯誤，從而進行正確的樣本數(shù)據(jù)回溯，提供更可靠的RNA-Seq分析。
實驗案例
分別使用250 pg -10 ng 的人腦部總RNA制備文庫，每個起始量2個技術(shù)重復(fù)。從下表可以看出不同起始量的情況下，測序數(shù)據(jù)非常相似。TPM≥0.1的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量超過60,000，并且保留了鏈來源信息。讀段中比對到核糖體cDNA的比例在14%到18%之間，即以250 pg 和10 ng RNA 起始制備的文庫具有高度一致性。
以上數(shù)據(jù)結(jié)果也證明，微量cfRNA起始時， 使用Pico v3可以得到同樣高品質(zhì)的文庫。
cfDNA文庫構(gòu)建
雖然cfDNA的應(yīng)用日趨成熟，但總有一些微量樣本無法用傳統(tǒng)技術(shù)完成高品質(zhì)文庫的構(gòu)建，特別是在進行腫瘤早期診斷有重要價值的稀有突變分析時。
ThruPLEX Tag-Seq HV Kit
ThruPLEX Tag-Seq HV試劑盒支持單管、三步操作，手動15 min，全程2 h，過程中無需轉(zhuǎn)管與純化，實驗小白也能輕松上手。
ThruPLEX Tag-Seq HV支持5-200 ng FFPE DNA、cfDNA起始，input volume為30 μl，無需樣品濃縮。
搭配UDI建庫，ThruPLEX Tag-Seq HV可以有效降低index hopping效應(yīng)，是高通量型Illumina測序儀的“友好伙伴”。
通過添加UMI，ThruPLEX Tag-Seq HV雙端總共可有144種UMI連接到DNA分子兩端，足以正確區(qū)分是測序錯誤還是真實的稀有突變。
實驗案例
Takara科學(xué)家采用ThruPLEX Tag-Seq HV 對10 ng 起始的Quan-Plex Patient-Like ctDNA標準品（AccuRef）構(gòu)建文庫，該ctDNA標準品帶有一系列特征化的不同頻率（0%，1%，5%）突變位點。文庫構(gòu)建完成后，腫瘤相關(guān)的基因采用IDT xGEN Pan Cancer Panel進行捕獲富集。結(jié)果顯示，目標區(qū)域的捕獲高效可靠，10 ng 起始的DNA樣本約有79%的reads來自或者接近目標區(qū)域。
隨后，Takara科學(xué)家用UMIs鑒定了ctDNA標準品中特定位點的實際突變頻率，結(jié)果顯示，檢測到的突變頻率分別與預(yù)期1%、5%的等位突變頻率接近，而陰性對照組沒有在位點處檢測到任何突變。
（數(shù)據(jù)來源于Takara Bio USA, Inc.）
以上結(jié)果表明，ThruPLEX Tag-Seq HV文庫構(gòu)建系統(tǒng)，具有流程完整、快速，文庫復(fù)雜度高，結(jié)果可靠性高，兼容困難樣本等特點，適用于腫瘤學(xué)研究等應(yīng)用領(lǐng)域。
另外，Takara在今年對產(chǎn)品進行了升級，推出了ThruPLEX Tag-Seq HV PLUS Kit：在ThruPLEX Tag-Seq HV的基礎(chǔ)上，整合了ThruPLEX HV PLUS Enzymatic Fragmentation Module的完整文庫構(gòu)建試劑盒。不僅保留了ThruPLEX HV的顯著功能，并且無需在文庫制備之前進行任何機械打斷或單獨的酶切片段化處理，從而實現(xiàn)了性能和速度的充分結(jié)合。
經(jīng)過上述的介紹，相信大家已經(jīng)對液體活檢的重要性以及游離核酸的建庫方案有了初步認識，也對Takara兼容cfDNA/RNA的SMARTer、ThruPLEX技術(shù)有所了解。上述涵蓋微量核酸起始、兼容不同品質(zhì)核酸、操作簡便等特點的SMARTer、ThruPLEX技術(shù)或許能助力相關(guān)實驗開展或項目研發(fā)。
文章來源：基因谷
